PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類巴比B 妥電泳緩沖液配置簡單介紹
0.05moI/L pH8.6 BBT緩沖液
BBT 1.84g
加蒸餾水 200ml 加熱溶解 BBT納 10.3g
疊氮納 0.2g
加蒸餾水溶解 , 并補(bǔ)加到 1000ml 。
B比 妥緩沖液(pH8.6): 取BBT5.52g與BBT鈉30.9g,加水使溶解成2000ml,即得。
BBT-氯化鈉緩沖液(pH7.8): 取BBT鈉5.05g,加氯化鈉3.7g及水適量使溶解,另取明膠0.5g加水適量,加熱溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.8,再用水稀釋至500ml,即得。
BBT電泳緩沖液(pH8.6)如何正確使用
醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng):
1.首先,裁剪適量尺寸濾紙條來搭建濾紙橋,再將緩沖液倒入電泳槽,在醋酸纖維素薄膜無光澤面做好點(diǎn)樣標(biāo)記。
2.然后,將該面在下浸入緩沖液約二十分鐘,在浸透*以后,取出吸取多余緩沖液的備用。
3.然后,用加樣器取適量蛋白樣品均勻加于點(diǎn)樣線處,最終形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。
4.然后,將點(diǎn)樣端位于負(fù)極,無光澤面朝下,平整放于濾紙橋上,平衡完畢后,調(diào)節(jié)電壓并開始電泳。
其他注意事項(xiàng):
1、醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理
市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片,薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的重要關(guān)鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面,其目的是選擇膜片厚薄及均勻度,如漂浮15s—30s時(shí),膜片吸水不均勻,則有白斑點(diǎn)或條紋,這提示膜片厚薄不勻,應(yīng)舍去不用,以免造成電泳后區(qū)帶扭曲,界線不清,背景脫色困難,結(jié)果難以重復(fù)。由于醋酸纖維薄膜親水性比紙小,浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液,并使其恢復(fù)到原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉,這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕著走。點(diǎn)樣時(shí),應(yīng)將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去,以免緩沖液太多引起樣品擴(kuò)散。但也不能吸得太干,太干則樣品不易進(jìn)入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi),而造成電泳起始點(diǎn)參差不齊,影響分離效果。吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋感染,取膜時(shí),應(yīng)戴指套或用鑷子。
2、緩沖液的選擇
醋酸纖維素薄膜電泳常選用 BBT電泳緩沖液(pH8.6),其濃度為0.05mol/L—0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的薄厚有關(guān)。選擇時(shí),先初步定下某一濃度,如電泳槽兩極之間的膜長度為8 cm—10cm,則需電壓25V/cm膜長,電流強(qiáng)度為0.4mA/cm—0.5mA/cm膜寬。當(dāng)電泳達(dá)不到或超過這個(gè)值時(shí),則應(yīng)增加緩沖液濃度或進(jìn)行稀釋。緩沖液濃度過低,則區(qū)帶泳動(dòng)速度快,并由于擴(kuò)散變寬;緩沖液濃度過高,則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢,區(qū)帶分布過于集中不易分辨。
3、加樣量
加樣品的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關(guān)。作為一般原則,檢測方法越靈敏,加樣量則越少,對分離更有利。如加樣量過大,則電泳后區(qū)帶分離不清楚,甚至互相干擾,染色也較費(fèi)時(shí)。如電泳后用洗脫法定量時(shí),每厘米加樣線上需加樣品0.1μl—0.5μl約相當(dāng)于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常規(guī)電泳分離時(shí),每厘米加樣線加樣量不超過1μl,相當(dāng)于60μg—80μg的蛋白質(zhì)。但糖蛋白和脂蛋白電泳時(shí),加樣量則應(yīng)多些。對每種樣品加樣量均應(yīng)先作預(yù)實(shí)驗(yàn)加以選擇。
點(diǎn)樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一,以印章法加樣時(shí),動(dòng)作應(yīng)輕、穩(wěn),用力不能太重,以免將薄膜弄壞或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。
4、電量的選擇
電泳過程應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度,一般電流強(qiáng)度為0.4mA/cm—0.5mA/cm寬膜為宜。電流強(qiáng)度高,尤其在溫度較高的環(huán)境中,可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效應(yīng)引起緩沖液中水分蒸發(fā),使緩沖液濃度增加,造成膜片干涸。電流過低,則樣品泳動(dòng)速度慢且易擴(kuò)散。
5、染色液的選擇
對醋酸纖維素薄膜電泳后染色應(yīng)根據(jù)樣品的特點(diǎn)加以選擇。其原則是染料對被分離樣品有較強(qiáng)的著色力,背景易脫色;應(yīng)盡量采用水溶性染料,不宜選擇醇溶性染料,以免引起醋酸纖維素膜溶解。
應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長,薄膜底色深不易脫去;時(shí)間短,著色淺不宜區(qū)分,或造成條帶染色不均,必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。
6、透明及保存
透明液應(yīng)臨用前配制,以免冰乙酸及乙醇揮發(fā)影響透明效果。這些試劑最好選用分析純。透明前,薄膜應(yīng)*干燥。透明時(shí)間應(yīng)掌握好,如在透明乙液中浸泡時(shí)間太長則薄膜溶解,太短則透明度不佳。
透明后的薄膜*干燥后才浸入石蠟中,使薄膜軟化。如有水,則液體石蠟不易浸入,薄膜不易平展。宜。
巴比B 妥電泳緩沖液配置簡單介紹
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