ELISA測定錯誤結(jié)果的原因分析
ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗，是一種常用的固相酶免疫測定方法。Engvall 和Perlmann于1971年zui先應(yīng)用該法進行了IgG定量測定，并命名為"enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）"。 ELISA的基本原理是：
①使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性；
②使抗原（或抗體）與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原（或抗體），而且此酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；
③測定時將受檢標(biāo)本（抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原（或抗體）按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進行反應(yīng)，再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開，zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的抗體或抗原量成一定比例；再加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)其顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析，以了解被測標(biāo)本中抗體或抗原含量。 
ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在研究檢驗中除正常反應(yīng)外，有時?？梢姷揭恍╁e誤結(jié)果（即假陽性或假陰性結(jié)果）。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有：
①標(biāo)本因素；
②試劑因素；
③操作因素。
本文就標(biāo)本因素對ELISA測定的影響做如下討論。 
血清是zui常用的ELISA標(biāo)本，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：
1． 內(nèi)源性物質(zhì) 有人認(rèn)為大約40%的科研血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig （s）抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。 
（1）類風(fēng)濕因子 
科研血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子（RF）可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性。
解決該情況的辦法是：
①用F（ab）2替代完整的IgG；
②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性（63℃，10 min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）；③檢測抗原時，可以用等加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。 
（2）補體 ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補體C1q分子結(jié)合位點被暴露出來，使C1q 可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。 
（3）嗜異性抗體 人類血清中含有能與嚙齒類動物（如鼠等）Ig （s） 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig （s） ，但加入量不足或亞類不同時無效。 
（4）嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結(jié)果。為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測定前需用理化方法將其解離后再測定。 
（5）醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig （s） 抗體 研究開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使這些樣本體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的樣本體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig （s） 抗體。這些樣本ELISA測定時均可產(chǎn)生假陽性。解決的辦法是：測定抗原時，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig （s） ，從而克服由于上述原因造成的假陽性。 
（6）交叉反應(yīng)物質(zhì) 類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測定抗原時，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應(yīng)的靶決定簇時，也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 
（7）標(biāo)本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等，均對ELISA測定結(jié)果有干擾作用。 
2． 外源性物質(zhì) 
外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細菌污染、標(biāo)本貯存過久、標(biāo)本凝集不全和采血管中添加物等影響。 
（1）標(biāo)本溶血 由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測定中，會導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時必須注意避免溶血。 
（2）標(biāo)本受細菌污染 因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。 
（3）標(biāo)本保存不當(dāng) 在冰箱中保存過久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深、甚至造成假陽性；標(biāo)本放置時間過長（如一天以上），有時抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測定，但混勻時應(yīng)輕柔，不可強烈振蕩。 
（4）標(biāo)本凝集不全 在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h*凝固。研究檢驗工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；這類情況于次日復(fù)查時因血凝已*，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮?。為避免上述干擾作用，解決的辦法是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?nbsp;
（5）標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響 抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性）及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定干擾作用。 綜上所述，對研究檢驗ELISA測定中出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果，在考慮試劑因素和操作因素之外，更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進行分析，并應(yīng)采取相應(yīng)措施排除干擾作用，從而為研究提供正確可靠的檢測結(jié)果。

酶聯(lián)免疫（ELISA）使用試劑盒檢測過程中值得關(guān)注的問題
1、儀器質(zhì)控
 為使儀器保持工作狀態(tài)，應(yīng)建立維護和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍）、溫箱、洗板機和酶標(biāo)儀。
◎移液器： ELISA加樣量?。?0-200μl），其準(zhǔn)確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：低、中、高三個刻度分別吸取指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在±5%以內(nèi)；
◎恒溫箱： 經(jīng)常檢查恒溫箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；
◎洗板機： 每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定，一般不超過2μl；人工扣板時，墊紙不濕；定期檢查管孔是否堵塞；
◎酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。
2、試劑盒選擇
◎應(yīng)盡量選擇正規(guī)廠家，產(chǎn)品經(jīng)相應(yīng)政府部門審核認(rèn)可，試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、安全性及經(jīng)濟性全面評價。
◎靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質(zhì)的zui低量的能力；2）為試劑對大量樣品中陽性檢出的能力。
◎特異性：常用交叉反應(yīng)率表示。含有與待測物相近結(jié)構(gòu)部份的物質(zhì)可能存在交叉反應(yīng)，使測定結(jié)果升高，可能導(dǎo)致假陽性，所以交叉反應(yīng)是評價其質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。
◎精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi)CV%，其值應(yīng)小于15%；定量試劑應(yīng)同時考察線性范圍。
◎準(zhǔn)確度：通過添加回收實驗進行評價。
◎簡便性：指在不影響試劑的前三項指標(biāo)的前題下，實驗和測定步驟越少越好，在定性實驗中結(jié)果判斷簡單明了，定量試驗結(jié)果計算也應(yīng)簡單。
◎安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。
◎經(jīng)濟性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生物試劑或技術(shù)進步降低成本，而市場價格比較合理。
◎試劑評價：需要有的確證方法和確證的樣品進行檢測。
3、樣本前處理注意事項
3.1 均質(zhì)
組織樣本:肉、肝食品類切細，用絞肉機反復(fù)絞碎，混合均勻。
水產(chǎn)樣本：去除樣品的非食用部分，食用部分切細，用均質(zhì)器均漿；原料表面較臟時,需適當(dāng)用蒸餾水清洗。
蛋類：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。
水果、蔬菜類：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
3.2 振蕩提取
 將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使提取溶劑與容器內(nèi)的樣品充分接觸以深入到樣本組織內(nèi)部，提取待測組分。
3.2.1振蕩方式：振蕩器上進行上下、往返式振蕩、手搖式上下振蕩。
3.2.2 在組織樣本中加入有機溶劑之間提取時，應(yīng)邊加邊振蕩，防止組織凝結(jié)成團，不利于提取。
3.3. 在用有機溶劑提取過程中，如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，解決的方法有：①用細頭輕輕的攪拌，破壞乳化后，再重復(fù)離心。②再加入適量的提取劑，重新振蕩。注意離心后要保證樣本的稀釋倍數(shù)不變。
3.4 濃縮
 由于凈化過程中引入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機溶劑。即試劑盒前處理步驟中把樣本在60℃氮氣下吹干，再用復(fù)溶液溶解干燥殘留物。
濃縮方式：
 氮氣吹干除雜、壓縮空氣吹干除雜。
注意：
3.4.1在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質(zhì)干擾。
3.4.2在吹樣本時，針頭應(yīng)在液面上空，避免與樣本接觸，防止產(chǎn)生交叉污染。
3.4.3樣本吹干后應(yīng)立即取下，避免吹的時間過長，影響zui終檢測結(jié)果。
3.4.4不同的藥物，吹干后樣本的保質(zhì)期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復(fù)溶。
3.5 凈化
 經(jīng)過提取的待測組分中通常含有一些會干擾試劑盒中抗原抗體反應(yīng)的雜質(zhì)或者是含有與待測物結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)。將待測組分與雜質(zhì)分離的過程，我們稱為試劑盒中樣本的凈化。在我們現(xiàn)有的試劑盒前處理方法中涉及到的zui常見的凈化是：液液分配法。
 比如：用復(fù)溶液溶解干燥殘留物之前先加入適量的正己烷，在加入正己烷和復(fù)溶液渦動后如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可以60℃水浴加熱，至乳化現(xiàn)象消失或減弱后，加大離心轉(zhuǎn)速進行離心。
 實例：
 A、氟喹諾酮類藥物試劑盒現(xiàn)有的水產(chǎn)樣本前處理方法中，用二氯甲烷作為提取劑。
注意：
 （a）二氯甲烷的密度比水大，離心完后，二氯甲烷在下層，須先用加樣器吸盡上層廢液后，再按要求取適量的下層吹干。
 （b）在用加樣器吸取下層的有機相時，正常操作往往取量不準(zhǔn)確，此時用帶有刻度，且刻度較準(zhǔn)確的玻璃管來定量。
 （c）上訴情況對有經(jīng)驗的試驗員還可以通過靈活控制加樣器來控制取樣的準(zhǔn)確性。
 （d）在振蕩過程中要注意安全。二氯甲烷在振蕩的過程中，如果離心管密封性不是很好，往往容易爆開；在進行振蕩時，不要讓離心管口對準(zhǔn)自己或者其他人，避免濺到自己或者他人身上。
 （e）試劑盒在使用前充分回溫很必要，如回溫不充分該項目曲線受影響較明顯。
    B、硝基呋喃代謝物檢測過程中常見問題
    硝基呋喃代謝物有四種：3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）和1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）在檢測過程中也需要同其它項目一樣進行添加回收測評，其中需要注意以下幾個問題。
    代謝物在組織中是與蛋白呈結(jié)合狀態(tài)，采用普通的有機溶劑或緩沖液，是無法提取該代謝物的。需要用鹽酸水解后才能使呋喃類代謝物游離，所以在加入去離子水、鹽酸和2-硝基苯甲醛（2-NBA）混合均勻后，其pH應(yīng)在1-3之間，否則不利用水解代謝物。
在衍生化過程中，溫度和時間決定其衍生化產(chǎn)率，衍生化后在加入氫氧化鈉和磷酸氫二鉀時，其pH應(yīng)在中性左右。由于部分樣本的緩沖能力不同，所以需對其pH進行測定，因為在酸性或堿性環(huán)境中，不利于呋喃類代謝物的提取回收，同時也容易出現(xiàn)假陽性。
    添加回收的幾種誤區(qū)：
    呋喃類代謝物提取過程通常分三個關(guān)鍵步驟：
 水解-----衍生化-----提取
 （1）采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的zui大標(biāo)準(zhǔn)濃度進行添加回收。如德國拜發(fā)和我公司AOZ試劑盒中的第6個標(biāo)準(zhǔn)點4.05ppb，AMOZ試劑盒中的第6個標(biāo)準(zhǔn)點8.1ppb。因為這些標(biāo)準(zhǔn)品是已經(jīng)過衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)品，不能代表樣本前處理實驗中的加酸水解和加衍生化試劑衍生這兩個步驟，所以就算回收率很高，但失去了實際參考價值。
 （2）*依賴未衍生的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品進行添加回收。因部分未衍生的代謝物在配制成標(biāo)準(zhǔn)品后有一定的有效期，會存在潛在的不穩(wěn)定因素，而且添加回收僅能考證衍生化和提取兩個關(guān)鍵點，不能驗證從組織蛋白中水解呋喃類代謝物的過程，因此也有一定的局限性。
 的評價方案：采用經(jīng)LC-MS-MS確證的陰陽性樣品，留作質(zhì)控樣品，對檢測的樣本和試劑盒進行質(zhì)量評價。這也是實驗室所出數(shù)據(jù)可信度說服力的關(guān)鍵點。
4、 酶標(biāo)分析過程中的注意事項
     樣本的檢測是基于抗原抗體的反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，判定樣本zui終的藥物含量。它要求加樣的準(zhǔn)確性和洗板的一致性。在整個加樣的過程中注意實驗室溫度的恒定，保證反應(yīng)在試劑盒所示的溫度下進行。
4.1常見加樣方式
A、吸一打二
B、吸二打一
 在實際操作過程中，提倡用“吸二打一"用這種方式，有如下幾個好處：
 a、加樣過程中在板孔內(nèi)不出現(xiàn)或者很少出現(xiàn)氣泡
 b、提高加樣速度，縮短前后樣本反應(yīng)的時間差。
在加樣的過程中還應(yīng)細心注意避免出現(xiàn)下列現(xiàn)象：
A、加樣的過程中漏加或者重加；
B、加樣的過程中忘記更換吸頭；
C、樣本的重加或者漏加；
D、忘記記錄樣本的加樣順序。
4.2常見的洗板方式
A、洗板機洗板；
B、多道孔加樣器洗板；
C、多孔吸頭洗板；
   在洗板的過程中，確保每孔所加洗滌液量的均一，按說明書操作，不可過多，避免溢出板孔，污染其它樣本；過少，則達不到洗滌的效果，容易出現(xiàn)曲線不成線性，花板等情況。
4.3 甩板
 快速甩盡板孔內(nèi)的液體，防止板孔里的液體對流或反濺回板孔中產(chǎn)生交叉污染。
4.4拍板
 輕輕的在吸水紙上扣干板孔內(nèi)的液體，而且吸水紙只能使用一次。
4.5 顯色
 值得注意的是，并非試劑盒中所規(guī)定的顯色時間是的，因為試劑盒的吸光度值會受環(huán)境中的溫度、濕度、酶標(biāo)板反應(yīng)時所接觸到的物品的導(dǎo)熱度等有關(guān)，實驗操作人員在加完顯色液后，可根據(jù)顏色的深淺適當(dāng)?shù)难娱L或者縮短顯色時間。防止出現(xiàn)吸光值接近或高于酶標(biāo)儀的zui高檢測靈敏度（OD值在2.5-3.0之間），這樣會間接影響到檢測結(jié)果，如出現(xiàn)曲線前半部份梯度不明顯或顛倒數(shù)值等現(xiàn)象，也就造成了一些假陽性或部分檢測結(jié)果偏低的現(xiàn)象。

ELISA技術(shù)要點和常見問題
在ELISA實驗前的注意事項 
仔細閱讀說明書確定試劑盒在有效期內(nèi)按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）標(biāo)本制備要規(guī)范，每份標(biāo)本體積要按2-3個復(fù)孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內(nèi)無法實驗者，注意低溫保存準(zhǔn)備好所有實驗額外所需物品，如試管、吸頭、移液器、離心機等根據(jù)檢測標(biāo)本數(shù)量確定所需試劑的量按說明書將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑
DIY夾心法ELISA常見技術(shù)指南 
選擇抗體時選擇一個單抗和一個多抗進行配對；若選擇兩個單抗，必須識別不同表位的抗體；從同一家公司選擇抗體對。ELISA實驗中為了確定佳信號和zui低背景應(yīng)將捕獲抗體（0.5-4μg/ml）和檢測抗體（0.25-2μg/ml）在預(yù)實驗中進行彼此相抗的滴定。同時，應(yīng)包括在適當(dāng)范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋。按試劑說明書常規(guī)提供的范圍進行操作。標(biāo)準(zhǔn)品的配制：對于每種細胞因子應(yīng)仔細閱讀說明書，注意每批的細節(jié)。在使用細胞因子前，瞬時離心試劑瓶，盡可能多地收回其中的細胞因子。根據(jù)每批說明書中的細節(jié)，將凍干的細胞因子復(fù)溶。一般待測抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍的可通過將標(biāo)準(zhǔn)品做8次2倍系列稀釋從2000pg/ml 到15pg/ml?？衫脴?biāo)準(zhǔn)的ELISA操作流程、放大試劑盒、第三類試劑、或改變酶底物系統(tǒng)可在一定范圍內(nèi)提高靈敏度。為了優(yōu)化靈敏度，建議過一晚孵育標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本。若使用過氧化物酶作為顯色系統(tǒng)，應(yīng)嚴(yán)禁在洗液和稀釋液中加疊氮鈉，疊氮鈉可抑制過氧化物酶的活性。當(dāng)測定混合液體中的抗原時，如血清，建議在標(biāo)本稀釋液中加不相干的Ig.
ELISA常見問題及處理對策 
問題 
可能原因 
解決方法 
無顏色
試劑孵育的時間沒有按說明書操作。確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時間是否適當(dāng)。
不同試劑盒或不同批號的試劑混用。重新檢查試劑的標(biāo)簽，確準(zhǔn)所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。
漏加酶檢查操作流程，注意不要漏加
HRP酶污染了疊氮鈉使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉
標(biāo)準(zhǔn)品有問題（若在標(biāo)本孔中有信號）按說明書檢查標(biāo)準(zhǔn)品的制備使用1瓶新標(biāo)準(zhǔn)品
某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質(zhì)盡可能用試劑盒內(nèi)容器,另覓一定要潔凈、可靠
使用含血清的緩沖液配制/復(fù)溶抗體重新確認(rèn)所選用的試劑
.漏加顯色劑A或B加顯色劑后觀察一下液面高度
試劑配制/使用有誤將實驗重做；嚴(yán)格按說明書操作，每次配制和使用前看清標(biāo)簽。
緩沖液污染配制新新鮮的緩沖液
顯色弱
超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號。檢查產(chǎn)品的有效期
加入試劑的體積和時間有誤確定所使用的每一個試劑的體積正確的和加入的時間是適當(dāng)?shù)摹?BR>試劑、樣品用前未能平衡用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右
縮短孵育時間能使實驗的信號變?nèi)?。檢查孵育的時間。
在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標(biāo)板。確定孵育的溫度，應(yīng)避免溫度的變化。
使用了被污染的試劑檢查試劑是否被污染。
標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本制備方法不規(guī)范檢查標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本的制備，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按說明書進行復(fù)溶和稀釋。低溫貯存的標(biāo)本避免反復(fù)凍融，嚴(yán)禁使用溶血標(biāo)本。樣品用NaN3防腐,抑制了酶的反應(yīng)
顯色底物制備不規(guī)范檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當(dāng)充分。
檢測時間不當(dāng)是否在規(guī)定的時間內(nèi)檢測。
儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。儀器是否設(shè)定正確，濾光片的使用等。
高背景（本底）
洗滌操作不規(guī)范洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應(yīng)*充滿洗滌緩沖液，傾出時應(yīng)迅速。若使用洗板機，應(yīng)校準(zhǔn)并設(shè)定足夠充滿每孔的體積量。板的內(nèi)側(cè)不應(yīng)接觸設(shè)備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準(zhǔn)確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。
實驗中孵育溫度和時間不適當(dāng)確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當(dāng)
酶加量過多加酶前驗看移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確。檢查稀釋度，若必要進行效價測定。
封閉不*檢查封閉液的計算量；提高封閉時間。
標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的干擾物質(zhì)做適當(dāng)?shù)膶φ?BR>顯色劑受光照時間較長,或污染顯色劑A和B應(yīng)于使用*分鐘從冰箱取出
整批樣品放置時間過長,樣品污染樣品應(yīng)保持新鮮,或低溫保存,防止污染
緩沖液污染制備新鮮的緩沖液
吸頭重復(fù)使用,未洗凈或消毒不*而用于加酶或顯色劑吸頭盡可能一次性使用
太多的信號：全部的板子變成規(guī)則的藍色不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結(jié)合的過氧化物酶仍有殘留。使用洗板機充分洗滌檢查孔內(nèi)是否有殘留的洗液或加樣量是否準(zhǔn)確。
底物溶液混合太早并轉(zhuǎn)成藍色應(yīng)控制底物混合的時機并立即使用
太多的酶結(jié)合物檢查稀釋度，必要時進行效價測定
封板膜或試劑容器被重復(fù)使用，導(dǎo)致HRP殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍色。使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器
緩沖液中污染金屬或HRP制備新鮮緩沖液
高CV值（CV：coefficient of variation），花板
操作不慎或洗滌不充分按說明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述
出現(xiàn)干板，沒有使用封板膜、封板膜重復(fù)使用確定每兩步驟間，酶標(biāo)板應(yīng)保持濕潤。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。
由于操作失誤或板子質(zhì)量差（結(jié)合不均勻）造成包板不均勻。稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）
移液器不準(zhǔn)確，吸頭重復(fù)使用。檢查并校準(zhǔn)移液器。每次取樣必須換吸頭?；仡櫂?biāo)本的加入步驟，確保每次加樣的準(zhǔn)確性，保證吸取的液體按所設(shè)定的體積吸入和排出，連續(xù)加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。
樣品離心處理不全,反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細胞成分標(biāo)本充分離心, 3000rpm 6分以上，嚴(yán)禁使用凝血（溶血）的標(biāo)本
緩沖液污染制備新鮮的緩沖液
標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到，但兩點之間區(qū)別很差（低或平的曲線）
酶結(jié)合物不足檢查稀釋度，必要時進行效價測定
捕獲抗體沒有很好結(jié)合到板上檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）稀釋用的PBS中不要加其它蛋白
檢測抗體不足檢查稀釋度，必要時進行效價測定
板子顯色不足延長底物孵育實驗使用推薦品牌的底物溶液
操作不慎回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。
標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋度計算有誤核查計算的情況，制備新的標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產(chǎn)生在標(biāo)本中無相應(yīng)的細胞因子使用內(nèi)參對照重復(fù)實驗，重新考慮實驗的相應(yīng)參數(shù)
標(biāo)本基質(zhì)遮蓋檢測將標(biāo)本至少做1∶2相應(yīng)的稀釋，或進行系列稀釋觀測它的恢復(fù)性
標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是標(biāo)本的判讀值很高標(biāo)本中含的細胞因子水平超過實驗范圍將標(biāo)本做稀釋并再次實驗
當(dāng)使用HRP酶結(jié)合物時，TMB底物加終止液后顯綠色孔中的試劑顯色不充分輕輕振蕩板子
邊緣效應(yīng)
工作環(huán)境溫度不均衡避免將板子在變化溫度環(huán)境中孵育
漂移
實驗過程中出現(xiàn)間斷整個實驗應(yīng)連續(xù)操作：在實驗開始前將所有標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本做適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)備
試劑沒有按說明書平衡至室溫在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說明書中有另外的要求。
是否可更改試劑盒  所提供的實驗操作步驟？
一般廠商為確保zui高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優(yōu)化，為確保每一試劑盒實驗的規(guī)范性應(yīng)按說明書操作。
是否可混用不同試劑盒中的試劑？
不行。絕大多數(shù)試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與廠家或代理商。
是否可增加或減少標(biāo)本的體積。
商品化的試劑盒所需加入的標(biāo)本體積是優(yōu)化的，應(yīng)按說明書操作，不建議更改所加標(biāo)本的體積。
是否可重確定自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線的點？
可以。說明書上有建議的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度，可改變稀釋倍數(shù)和增加曲線的點，但是必須在實驗范圍內(nèi)，高于試劑盒中zui高標(biāo)準(zhǔn)品的點和低于靈敏度以下的點是無效的。